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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:hbz:385-5830
URL: http://ubt.opus.hbz-nrw.de/volltexte/2010/583/


Characterization of N-acetyltransferase 1 in human monocyte-derived dendritic cells and keratinocytes and its modulation by monocyclic arylamines

Charakterisierung der N-Acetyltransferase 1 in humanen Dendritischen Zellen und Keratinozyten sowie N-Acetyltransferase 1 Modulation durch monozyklische Arylamine

Bonifas, Jutta

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SWD-Schlagwörter: Haut
Freie Schlagwörter (Deutsch): Keratiniozyten, epidermale dendritische Zellen, Fremdstoffmetabolismus, N-Acetyltransferase 1 (NAT1), para-Phenylendiamin (PPD)
Freie Schlagwörter (Englisch): Keratinocytes, epidermal dendritic cells, xenobiotic metabolism, N-acetyltransferase 1 (NAT1), para-phenylenediamine (PPD)
Institut: Geographie und Geowissenschaften
Fakultät: Fachbereich 6
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Blömeke, Brunhilde (Univ.-Prof. Dr. rer. nat.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.06.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 20.07.2010
Kurzfassung auf Englisch: N-acetylation by N-acetyltransferase 1 (NAT1) is an important biotransformation pathway of the human skin and it is involved in the deactivation of the arylamine and well-known contact allergen para-phenylenediamine (PPD). Here, NAT1 expression and activity were analyzed in antigen presenting cells (monocyte-derived dendritic cells, MoDCs, a model for epidermal Langerhans cells) and human keratinocytes. The latter were used to study exogenous and endogenous NAT1 activity modulations. rnWithin this thesis, MoDCs were found to express metabolically active NAT1. Activities were between 23.4 and 26.6 nmol/mg/min and thus comparable to peripheral blood mononuclear cells. These data suggest that epidermal Langerhans cells contribute to the cutaneous N-acetylation capacity. Keratinocytes, which are known for their efficient N-acetylation, were analyzed in a comparative study using primary keratinocytes (NHEK) and different shipments of the immortalized keratinocyte cell line HaCaT, in order to investigate the ability of the cell line to model epidermal biotransformation. N-acetylation of the substrate para-aminobenzoic acid (PABA) was 3.4-fold higher in HaCaT compared to NHEK and varied between the HaCaT shipments (range 12.0–44.5 nmol/mg/min). Since B[a]P induced cytochrome p450 1 (CYP1) activities were also higher in HaCaT compared to NHEK, the cell line can be considered as an in vitro tool to qualitatively model epidermal metabolism, regarding NAT1 and CYP1. The HaCaT shipment with the highest NAT1 activity showed only minimal reduction of cell viability after treatment with PPD and was subsequently used to study interactions between NAT1 and PPD in keratinocytes. Treatment with PPD induced expression of cyclooxygenases (COX) in HaCaT, but in parallel, PPD N-acetylation was found to saturate with increasing PPD concentration. This saturation explains the presence of the PPD induced COX induction despite the high N-acetylation capacities. A detailed analysis of the effect of PPD on NAT1 revealed that the saturation of PPD N-acetylation was caused by a PPD-induced decrease of NAT1 activity. This inhibition was found in HaCaT as well as in primary keratinocytes after treatment with PPD and PABA. Regarding the mechanism, reduced NAT1 protein level and unaffected NAT1 mRNA expression after PPD treatment adduced clear evidences for substrate-dependent NAT1 downregulation. These results expand the existing knowledge about substrate-dependent NAT1 downregulation to human epithelial skin cells and demonstrate that NAT1 activity in keratinocytes can be modulated by exogenous factors. Further analysis of HaCaT cells from different shipments revealed an accelerated progression through the cell cycle in HaCaT cells with high NAT1 activities. These findings suggest an association between NAT1 and proliferation in keratinocytes as it has been proposed earlier for tumor cells. rnIn conclusion, N-acetylation capacity of MoDCs as well as keratinocytes contribute to the overall N-acetylation capacity of human skin. NAT1 activity of keratinocytes and consequently the detoxification capacities of human skin can be modulated by the presence of exogenous NAT1 substrates and endogenous by the cell proliferation status of keratinocytes. rn
Kurzfassung auf Deutsch: N-acetyltransferase 1 (NAT1) abhängige N-Acetylierung ist ein wichtiger Reaktionsweg im Rahmen der Biotransformation von Fremdstoffen in humaner Haut. Die Reaktion ist unter anderem an der Deaktivierung des Arylamins und bekannten Kontaktallergens para-Phenylenediamin (PPD) beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wird die NAT1 Expression und Aktivität in antigen-präsentierenden Zellen (monozyten-generierte dendritische Zellen als Modell für epidermale Langerhans Zellen) und humanen Keratinozyten charakterisiert. Letztere dienten des Weiteren dazu, die Interaktionen zwischen NAT1 und PPD zu analysieren sowie endogene Modulationen der NAT1 Aktivität zu untersuchen. rnDendritische Zellen spielen eine zentrale Rolle im Rahmen der Initiation von allergischen Hautreaktionen, indem sie Antigene internalisieren, prozessieren und den T-Zellen präsentieren. Darüber hinaus sind sie möglicherweise auch an der Biotransformation von Haptenen beteiligt und beeinflussen so die Konzentrationen an Immunogenen in der Haut. In dieser Arbeit konnte metabolisch aktive NAT1 in monozyten-generierten dendritischen Zellen (MoDCs) nachgewiesen werden. Diese Zellen waren in der Lage, PPD in seine acetylierten Derivate um zu setzen. Die NAT1 Aktivität der MoDCs lag in einem PBMCs und mit Literaturwerten der monozytischen Zelllinie THP-1 vergleichbaren Bereich. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass auch epidermale dendritische Zellen zu der N-Acetylierungskapazität humaner Haut beitragen können. Die fremdstoffmetabolisierende Aktivität von Keratinozyten, die für eine effiziente N-Acetylierung vieler verschiedener Substrate bekannt sind, wurde in neonatalen normalen humanen epidermalen Keratinozyten (NHEK, primäre Keratinozyten) und drei verschiedenen (Liefer-)Chargen der immortalisierten Keratinozytenzelllinie HaCaT vergleichend charakterisiert. Ziel dieser Studie war es herauszufinden, inwiefern die Zelllinie den epidermalen Fremdstoffmetabolismus hinsichtlich NAT1 und Cytochrom p450 1 (CYP1) Aktivität repräsentieren kann. Die N-Acetylierung des Substrates para-Aminobenzoesäure (PABA) war in HaCaT 3.4-fach höher als in NHEK und die NAT1 Aktivitäten variierten zwischen den einzelnen HaCaT Chargen im Bereich von 12.0 bis 44.5 nmol/mg/min (n=14). Diese Variabilität konnte ebenfalls für die NAT1 Promoter 1 abhängige (P1) mRNA Expression sowie für die N-Acetylierung von PPD unter typischen in vitro Testbedingungen gezeigt werden. Da auch die durch 1 µM Benzo[a]pyren induzierte CYP1 in HaCaT deutlich stärker war als in NHEK, kann die Zelllinie als ein geeignetes Werkzeug zur qualitativen in vitro Modellierung des epidermalen Fremdstoffmetabolismus hinsichtlich NAT1 und CYP1 Aktivitäten betrachtet werden. Die HaCaT Charge mit der höchsten NAT1 Aktivität zeigte die geringste Reduktion der Zellvitabilität nach PPD Behandlung und wurde daher im Folgenden verwendet, um Interaktionen zwischen NAT1 und dem Kontaktallergen PPD in Keratinozyten zu untersuchen. Die höchste NAT1 Aktivität wurde in HaCaT Zellen gemessen, die in der G0/G1 Phase des Zellzyklus akkumuliert waren, jedoch konnte ebenfalls unter diesen Bedingungen eine PPD-induzierte Cyclooxygenase (COX) Expression und Prostaglandin Bildung festgestellt werden. Die folgende konzentrationsabhängige Untersuchung zeigte eine Sättigung der N-Acetylierung von PPD mit steigenden PPD Konzentrationen, wodurch die COX Induktion durch PPD trotz der hohen NAT1 Aktivität der HaCaT Zellen zu erklären ist. Eine detailierte Analyse des Einflusses von PPD auf die NAT1 Aktivität in HaCaT zeigte, dass die Sättigung der N-Acetylierung von PPD nicht auf einer einfachen biochemischen Enzym Sättigung beruht, sondern durch eine vom PPD selbst induzierten Verringerung der NAT1 Aktivität hervorgerufen wurde. Die Hemmung der NAT1 wurde sowohl in HaCaT als auch in NHEK nach Behandlung mit PPD und PABA nachgewiesen. Hinsichtlich des Mechanismus, der dieser Hemmung zu Grunde liegt, lieferte das reduzierte NAT1 Proteinlevel und die unveränderte NAT1 P1 mRNA Expression nach PPD Behandlung klare Beweise für eine Substrat-abhängige NAT1 Hemmung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die NAT1 Aktivität in humanen Keratinozyten durch exogene Faktoren moduliert werden kann. Weitere Untersuchungen der HaCaT Zellen aus unterschiedlichen Chargen zeigte für HaCaT Zellen mit höherer NAT1 Aktivität ein schnelleres Fortschreiten der Zellen durch den Zellzyklus. HaCaT Zellen mit niedriger NAT1 Aktivität zeigten längere Verdopplungszeiten und entsprechend geringere Werte für weitere Zellzahl-abhängige Parameter. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass auch in Keratinozyten eine Assoziation zwischen NAT1 und Zell Proliferation vorliegt. Da die Basalschicht der Keratinozyten in der Haut die höchste Proliferationsrate aufweist, liegt ggf. in dieser Hautschicht auch die höchste N-Acetylierungskapazität vor. rnZusammenfassend lässt sich sagen, dass im Rahmen dieser Arbeit erstmals die N-Acetylierungsaktivität monozyten-generierter dendritischer Zellen (MoDCs) als Modell für dendritische Zellen nachgewiesen und die NAT1 Aktivität von humanen Keratinozyten detailliert charakterisiert wurde. Neben den Keratinozyten tragen möglicherweise auch antigen-präsentierende Zellen (hier gezeigt am Modell MoDCs) zur gesamten N-Acetylierungskapazität der humanen Haut bei. Die NAT1 Aktivität von Keratinozyten und demzufolge auch die Detoxifizierungskapazität humaner Haut kann durch den Einfluss von NAT1 Substraten selbst oder endogen durch den Proliferationsstatus der Zellen moduliert werden.rn

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