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The impact of ascaridol on human monocyte-derived dendritic cells and on the monocytic leukemia cell line THP-1

Der Einfluss von Ascaridol auf aus Monozyten generierte dendritische Zellen und die Monozytenzelllinie THP-1

  • The skin is continuously challenged by environmental antigens that may penetrate and elicit a skin sensitization, which can develop into allergic contact dermatitis. Medical treatment for allergic contact dermatitis is limited - in fact only acute symptoms can be cured and for secondary prevention of the disease a lifelong avoidance of the allergen(s) is necessary. Therefore, the screening of the sensitization potential of substance used in commercially available products is indispensable to prevent such diseases. Hence, risk assessment is deduced from data obtained by murine local lymph node assay predominantly, but there exists a need to develop methods capable of providing the same information that do not require the use of animals in view of legislative initiatives such as REACH (registration, evaluation, authorization of chemicals) as well as the 7th Amendment to the Cosmetics Directive (2003/15/EC). Therefore, a number of promising in silico and in vitro approaches are being developed to address this need. In vitro test systems using the response of dendritic cells, which are the key player in the elicitation process of contact dermatitis, are established, but, although these novel methods for hazard identification might find application in the context of screening, it is not clear whether these approaches are useful for the purposes of risk assessment and risk management to predict allergic potency. Therefore, it was investigated whether on the one hand in vitro generated dendritic cells from primary blood monocytes (MoDC) and on the other hand a continuous monocytic cell line, the THP-1 cells, suggested as dendritic cell surrogate, react to a presumably weak allergen. Ascaridol, predicted as one of the possible causes for tea tree oil contact dermatitis, was studied and its effects in these two in vitro skin sensitization models were explored. Thus, the surface expression of CD86, HLADR, CD54, and CD40, which are known as activation markers in both in vitro models, were measured via flow cytometry. For MoDC, an augmented CD86 and HLADR surface expression in comparison to untreated cells were determined after 24 h exposure with ascaridol. An increased CD54 and CD40 surface expression were found only in some donors. After long term incubation of 96 h, ascaridol-treated MoDC still up-regulated CD86 and additionally an augmented CD40 expression was measured in all studied donors. An enhanced CD54 expression was determined for 50 percentage of all investigated donors. Furthermore, CD80, CD83 and CD209 protein expression were up-regulated in MoDC after 96 h of ascaridol incubation. In addition, it was determined that after 24 h ascaridol-treated MoDC showed an increased capacity to uptake antigens, whereas after 96 h this capacity got lost and antigen-capturing devices were reduced in comparison to non-treated MoDC. Moreover, the cytokine release of ascaridol-treated MoDC were measured after 24 h. Tumor necrosis factor (TNF)alpha, interleukin (IL)-1beta and IL 6 secretion were determined in some donors. Furthermore, IL-8 release was clearly increased after 24 h ascaridol treatment. By the same token, THP-1 cells were analyzed after ascaridol treatment for several activation markers. We found a similar response pattern as measured in MoDC. Ascaridol induced CD86 expression as well as CD54 after 24 h incubation. Additionally, the impact of ascaridol on phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase, which had been shown to be involved in increased expression of activation markers like CD86 by others, were studied via Western blot analysis. A phosphorylation of p38 was determined after 15 min of ascaridol stimulation. Moreover, an augmented CD40 and HLADR surface expression were measured in a dose-response manner after 24 h ascaridol treatment. Also similar to MoDC an enhanced IL-8 secretion after ascaridol stimulation was observed in THP-1 cells. Hence, for the first time it was shown that ascaridol has immuno-modulating effects. The obtained data from both in vitro systems, MoDC and THP-1 cells, identified ascaridol as a sensitizer. Although for both systems there remain significant challenges to overcome for potency assessment, ascaridol is presumed to be a weak sensitizer probably. Interestingly, ascaridol treatment of THP-1 cells resulted also in an increased augmentation of CD184 and CCR2, two chemokine receptors expressed on monocyte. Therefore, these data encouraged the exploration of chemokine receptors as tools in skin sensitization prediction. Consequently, the combination of chemical assays with in vitro techniques may provide a useful surrogate to animal testing for skin sensitization. Due to the continuously changing environmental conditions, it is necessary to regularly monitor and update the spectrum of sensitizers that elicit contact dermatitis. Therefore, both debated in vitro test systems will become indispensable tools.
  • Täglich ist unsere Haut verschiedensten Umweltreizen ausgesetzt. Substanzen mit kleinem Molekulargewicht u. a. aus kosmetischen Produkten, Arzneimitteln, Kleidung und anderen Gegenständen des alltäglichen Umganges stammend, können durch die Haut in den Körper eindringen und Hautveränderungen hervorrufen. Das bekannteste Beispiel für Hautkrankheiten ist die Kontaktallergie. Sie äußert sich in Entzündungsreaktionen wie Rötungen, Ödeme, Bläschen, Schuppen, Knötchen oder Hautabschälungen. Eine Heilung für Patienten gibt es bislang nicht. Die Vermeidung der entsprechenden Allergene ist bisher die erfolgreichste Strategie, um das Auslösen dieser Krankheit zu verringern. Daher ist das Erkennen von Kontaktallergie auslösenden Substanzen entscheidend für einen gesicherten Verbraucherschutz. Bislang werden die Hautsensibilisierungspotenziale von chemischen Stoffen durch Tierversuche wie dem lokalen Lymphknoten-Test in der Maus oder dem Meerschweinchen-Maximierungstest validiert. Im Zuge der neuen europäischen Chemikalienverordnung REACH und der Europäischen Direktive vom 15. März 2003 gibt es große Bestrebungen in vitro Systeme zu entwickeln, aus denen die gleiche Information abgeleitet, aber die Anzahl der Tierversuche verringert werden kann. Die dendritische Zelle, welche die durch die Haut eindringenden Substanzen zu erkennen vermag, nimmt bei der Entwicklung einer Kontaktdermatitis eine Schlüsselposition ein. Die Reaktion der dendritischen Zelle auf eine Substanz entscheidet, ob sich eine Kontaktdermatitis bildet oder nicht. Daher basieren einige in vitro Systeme zur Validierung von Sensibilisierungspotenzialen auf in vitro generierten dendritischen Zellen. Es wird zum Beispiel der Einsatz von aus Blutmonozyten abgeleitete dendritische Zellen, so genannte MoDC, oder adäquate Ersatzzellen wie die Monozytenzelllinie THP-1 untersucht. Beide Zellmodelle können bekannte, stark sensibilisierende Chemikalien von Reizstoffen unterscheiden. Aber ob diese in vitro Modelle über eine ausreichende Sensitivität verfügen, die das Erfassen von schwachen und milden Sensibilisierungspotentialen von Allergenen ermöglicht, bedarf weiterer Forschung. Daher wurden beide Systeme herangezogen, um ein schwaches Allergen zu charakterisieren. Die Reaktion auf Ascaridol, eine Substanz, die im Zusammenhang mit Teebaumöl-Kontaktdermatitis diskutiert wird, wurde im Folgenden analysiert. Dazu wurde einerseits die Ausprägung von Oberflächenproteinen bestimmt, die eine Aktivierung der dendritischen Zelle anzeigen, und andererseits die Ausschüttung von pro-inflammatorischen Mediatoren gemessen. Eine 24-stündige Exposition von MoDC mit Ascaridol resultierte in einer erhöhten Expression von ko-stimulierenden Molekülen wie CD86 und HLADR. Des Weiteren wurden im Vergleich zu unbehandelten Zellen in einigen Spendern erhöhte Konzentrationen von Tumornekrosefaktor (TNF)alpha, Interleukin (IL)-1beta sowie IL-6 gefunden. Für alle untersuchte Spender wurde auch eine höhere IL-8 Konzentration gemessen. Im Weiteren wurde zur Untersuchung der späten Reifung der dendritischen Zellen eine 96-stündige Inkubation mit Ascaridol durchgeführt. Die gesteigerte CD86 Expression wurde wiedergefunden, begleitet von einer verstärkten Expression von CD80, CD40, CD83 und CD209. Die Hälfte aller untersuchten Spender zeigte sowohl nach 24 als auch nach 96 Stunden eine erhöhte CD54 Expression. Demnach konnte also bereits nach einer 24-stündigen Stimulation mit Ascaridol eine Aktivierung der MoDC festgestellt werden. Einer längeren Inkubation mit Ascaridol folgte ein verstärkter immun-modulatorischer Einfluss, der sich in der gesteigerten Expression von weiteren Aktivierungsmarkern widerspiegelte. Die Stimulation von THP-1 Zellen mit Ascaridol resultierte in einer Dosis-abhängigen erhöhten Expression von CD86 and CD54. Des Weiteren wurde auch eine erhöhte Expression von CD40 und HLADR gefunden. Ebenfalls wurde im Vergleich zu unbehandelten Zellen eine höhere Konzentration von IL-8 in Zellkulturüberständen gemessen. Damit kann Ascaridol auch in THP-1 Zellen eine Aktivierung auslösen und verglichen mit den von Sakaguchi et al. (2007) etablierten Kriterien für THP-1 Zellen als Testsystem zur Erkennung von Chemikalien mit sensibilisierenden Eigenschaften, als Sensibilisierer eingestuft werden. Da die Reaktion auf Ascaridol in beiden in vitro Systemen nicht zur vollständigen Aktivierung der jeweiligen Zellen führte, sollte Ascaridol als schwacher Sensibilisierer klassifiziert werden. Die vorliegende Studie zeigt auf, dass beide in vitro Modelle auch schwache Sensibilisierer erkennen können und ermutigt daher die Erforschung dieser Modelle als mögliche Testsysteme zur Vorsortierung von Substanzen mit Sensibilisierungspotential bei der Erfassung von neuen Chemikalien.

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Metadaten
Author:Corinna Tietze
URN:urn:nbn:de:hbz:385-4844
Advisor:Brunhilde Blömeke
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of completion:2008/07/28
Publishing institution:Universität Trier
Granting institution:Universität Trier, Fachbereich 4
Date of final exam:2008/07/11
Release Date:2008/07/28
Tag:Ascaridol; MoDZ; THP-1; dendritische Zellen
MoDC; THP-1; ascaridol; dendritic cells; skin sensitization
GND Keyword:Kontaktdermatitis; Sensibilisierung <Immunologie>; Terpene
Institutes:Fachbereich 6 / Geographie und Geowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 13581 $