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Allergische Kontaktdermatitis ist eine zellvermittelte verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion auf niedermolekulare Substanzen, die häufig Hautreaktionen hervorrufen und dadurch sowohl persönliche als auch berufliche Probleme verursachen. Chemikalien wie para-Phenylendiamin (PPD) und andere verwandte para-Aminobenzole werden häufig in Farben eingesetzt und erlangen aufgrund ihrer starken Allergenität eine immer größere Aufmerksamkeit. Bis jetzt ist das Wissen über zelluläre Immunantworten auf PPD nur begrenzt verstanden. In dieser Studie haben wir das immunmodulatorische Potential vonrnPPD untersucht, vor allem hinsichtlich der Fragestellung, ob PPD selber naive T-Zellen sensibilisieren kann oder ob PPD letztendlich nur ein Allergen ist. In Anbetracht der Tatsache das dendritische Zellen (DZ) eine vorherrschende Rolle bei der allergischen Kontaktdermatitis spielen, haben wir untersucht, in wie weit PPD in der Lage ist, funktionelle Reifung zu modulieren. Um abschätzen zu können, welcher Anteil an PPD nach der Stimulation zur potentiellen Aktivierung tatsächlich zur Verfügung steht, haben wir die metabolische Kompetenz von "monocyte derived dendritic cells" (MoDC) untersucht, PPD zurnacetylieren. Dazu haben wir die N-Acetyltransferase 1 (NAT-1) und N-Acetyltransferase 2(NAT-2) mRNA Expression charakterisiert und weitergehend die metabolische Aktivität von NAT-1 Enzym bestimmt. Mit diesen Versuchen konnten wir zeigen, dass MoDC von 9 aus 10 Spendern das NAT-1 Enzym exprimieren und konnten in 4 von 6 Spendern acetyliertes PPD in Extrakten aus Zellkulturüberständen detektieren. In Anbetracht der Tatsache, dassrnacetyliertes PPD nicht in der Lage ist, MoDC zu aktivieren, können wir davon ausgehen,dass der Anteil an acetyliertem PPD zur DC Aktivierung nicht zur Verfügung steht. Um das sensibilisierende Potential von PPD herauszufinden, haben wir nach Stimulation mit verschiedenen PPD Konzentrationen die Expression von Oberflächenmolekülen, die für die Antigenpräsentation, Co-Stimulation, späte Migration und dendritische Zell-/T-Zell-Wechselwirkung entscheidend sind, zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Durchflusszytometrie Messungen (FACS) gemessen. Zusammengefasst konnten wir zeigen,dass PPD signifikant die "chemokine receptor 7" (CCR7) Expression und nicht signifikant die "human leukocyte antigen " DR" HLA-DR, "DC-specific C-type lectin intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin" (DC-SIGN) und "cluster domain" 11c (CD11c) Expression erhöht. Die erhöhte CCR7 Expression ermutigte uns, weiter nachzuforschen, ob PPD trotz der Tatsache, dass es keine traditionelle CD80 und CD86 Expression induzieren kann, fähig ist, DCs zu aktivieren. Ausgiebige Zytokinkinetikmessungen konnten diese Hypothese bestätigen. Mit Cytometric Beat Array (CBA) Messungen konnten wir gleichzeitig Mediatoren wie "Interleukin -1ß" (IL-1ß), "tumor necrosis factor-alpha" (TNF-α), IL-8, IL-6, IL-12P70 undrnIL-10 messen und damit demonstrieren, dass PPD in der Lage ist, bei allen Spendern "Danger Signals" zu induzieren. Zudem konnten wir zeigen, dass die PPD induzierte Zytokinausschüttung interindividuell schwankte und zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgte. Überraschenderweise war die qualitative Zusammensetzung der Zytokine vergleichbar. Während in 3 von 4 Spendern die Zytokinexpression eher schwach erhöht war und von kurzer Dauer, haben wir in einem Spender vor allem mit den Konzentrationen von 10μM und 50μM PPD verblüffend hohe Zytokinausschüttungen gemessen. Dieser Spenderrnscheint eine Person zu repräsetieren, die empfänglicher für eine PPD Sensibilisierung ist als andere. Unabhängig davon, hat uns die Tatsache, dass PPD in allen Spendern "Danger Signals", aber keine gesteigerte Expressionsrate von traditionellen Reifungsmarkern (mit Ausnahme von CCR7) induzierte, veranlasst zu untersuchen, ob PPD anderweitig fähig ist,in MoDC Immunantworten zu modulieren. Daraufhin haben wir den Einfluss von PPD aufrnaktivierte DCs gemessen und die Ergebnisse bestätigten die Annahme. Weiterhin konnten wir zeigen, dass PPD immunogenes Potential aufweist. Aufgrund der Tatsache, dass die LPS induzierten Signaltransduktionswege in MoDC gut charakterisiert sind, konnten wir mit dieser Studie zusätzlich Hinweise über die PPD induzierte Signalgebung liefern.
The skin is continuously challenged by environmental antigens that may penetrate and elicit a skin sensitization, which can develop into allergic contact dermatitis. Medical treatment for allergic contact dermatitis is limited - in fact only acute symptoms can be cured and for secondary prevention of the disease a lifelong avoidance of the allergen(s) is necessary. Therefore, the screening of the sensitization potential of substance used in commercially available products is indispensable to prevent such diseases. Hence, risk assessment is deduced from data obtained by murine local lymph node assay predominantly, but there exists a need to develop methods capable of providing the same information that do not require the use of animals in view of legislative initiatives such as REACH (registration, evaluation, authorization of chemicals) as well as the 7th Amendment to the Cosmetics Directive (2003/15/EC). Therefore, a number of promising in silico and in vitro approaches are being developed to address this need. In vitro test systems using the response of dendritic cells, which are the key player in the elicitation process of contact dermatitis, are established, but, although these novel methods for hazard identification might find application in the context of screening, it is not clear whether these approaches are useful for the purposes of risk assessment and risk management to predict allergic potency. Therefore, it was investigated whether on the one hand in vitro generated dendritic cells from primary blood monocytes (MoDC) and on the other hand a continuous monocytic cell line, the THP-1 cells, suggested as dendritic cell surrogate, react to a presumably weak allergen. Ascaridol, predicted as one of the possible causes for tea tree oil contact dermatitis, was studied and its effects in these two in vitro skin sensitization models were explored. Thus, the surface expression of CD86, HLADR, CD54, and CD40, which are known as activation markers in both in vitro models, were measured via flow cytometry. For MoDC, an augmented CD86 and HLADR surface expression in comparison to untreated cells were determined after 24 h exposure with ascaridol. An increased CD54 and CD40 surface expression were found only in some donors. After long term incubation of 96 h, ascaridol-treated MoDC still up-regulated CD86 and additionally an augmented CD40 expression was measured in all studied donors. An enhanced CD54 expression was determined for 50 percentage of all investigated donors. Furthermore, CD80, CD83 and CD209 protein expression were up-regulated in MoDC after 96 h of ascaridol incubation. In addition, it was determined that after 24 h ascaridol-treated MoDC showed an increased capacity to uptake antigens, whereas after 96 h this capacity got lost and antigen-capturing devices were reduced in comparison to non-treated MoDC. Moreover, the cytokine release of ascaridol-treated MoDC were measured after 24 h. Tumor necrosis factor (TNF)alpha, interleukin (IL)-1beta and IL 6 secretion were determined in some donors. Furthermore, IL-8 release was clearly increased after 24 h ascaridol treatment. By the same token, THP-1 cells were analyzed after ascaridol treatment for several activation markers. We found a similar response pattern as measured in MoDC. Ascaridol induced CD86 expression as well as CD54 after 24 h incubation. Additionally, the impact of ascaridol on phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase, which had been shown to be involved in increased expression of activation markers like CD86 by others, were studied via Western blot analysis. A phosphorylation of p38 was determined after 15 min of ascaridol stimulation. Moreover, an augmented CD40 and HLADR surface expression were measured in a dose-response manner after 24 h ascaridol treatment. Also similar to MoDC an enhanced IL-8 secretion after ascaridol stimulation was observed in THP-1 cells. Hence, for the first time it was shown that ascaridol has immuno-modulating effects. The obtained data from both in vitro systems, MoDC and THP-1 cells, identified ascaridol as a sensitizer. Although for both systems there remain significant challenges to overcome for potency assessment, ascaridol is presumed to be a weak sensitizer probably. Interestingly, ascaridol treatment of THP-1 cells resulted also in an increased augmentation of CD184 and CCR2, two chemokine receptors expressed on monocyte. Therefore, these data encouraged the exploration of chemokine receptors as tools in skin sensitization prediction. Consequently, the combination of chemical assays with in vitro techniques may provide a useful surrogate to animal testing for skin sensitization. Due to the continuously changing environmental conditions, it is necessary to regularly monitor and update the spectrum of sensitizers that elicit contact dermatitis. Therefore, both debated in vitro test systems will become indispensable tools.